مروری بر جستجو و ردیابی لژیونلا به روش PCR

معرفی باکتری لژیونلا: لژیونلاها باسیل های کوچک، هوازی وگرم منفی به ابعاد 2×7/0-5/0 میکرون هستند که توانايي بقاء درآبهاي با درجه حرارت و pHگوناگون، موادمغذي و اكسيژن را دارند . باکتری لژیونلا عامل دو نوع بیماری لژیونلوزیس و تب پونتیک با شدت و علایم کلینیکی متفاوت است که دارای 51 گونه و 72 سروگروپ می باشد . گونه پنوموفیلا 15 سروگروپ دارد و 85 درصد عفونت های انسانی به سروگروپ های 1،4،6 ارتباط دارد هم چنین 2 تا 15 درصد از موارد بستری پنومونی اکتسابی ریوی و دومین عامل نیاز به مراقبت های ICU در میان بیماران مبتلا به پنومونی اکتسابی ریوی به گونه لژیونلا مرتبط است. هر چند 20 گونه از این باکتری می تواند عامل عفونت وبیماری در انسان باشد اما لژیونلا پنوموفیلا شایع ترین گونه عامل عفونت در انسان گزارش شده است . این باکتری گرم منفی به صورت همزیستی با آمیب در منابع آبی زندگی می کند که این شرایط باکتری را در برابر اوضاع نامساعد محیطی محافظت می کند . از طرفی داشتن دیواره سلولی پیچیده متشکل از دو غشای لیپیدی و یک لایه پپتیدوگلیکان ، ساختار غشا بیرونی باکتری را در برابر آنتی بیوتیک ها و مواد ضد عفونی کننده محافظت می کند.

تاریخچه و اپیدمیولوژی :

اولین شیوع عفونت لژیونلا در حدود 40 سال پیش در نظامیان آمریکا باعث مرگ 34 لژیونر نظامی گردید . بعد از شناسایی این باکتری مشخص شد که آلودگی با لژیونلا انتشار جهانی دارد مرگ ومیر ناشی از لژیونلا پنوموفیلا به علت استنشاق آئروسل های آلوده 5 تا 40 درصد بر آورد گردید، که این میزان در بین بیماران بستری شده در بیمارستان تا بیش از 40 درصد گزارش شده است. بر اساس گزارش های مرکز کنترل بیماریها شیوع لژیونلا در محیط های بیمارستانی بین 25-40 درصد می باشد . در اروپا به طور معمول به ازای یک میلیون جمعیت ، 2/8 نفر به بیماری لژیونلوزیس دچار می شوند. مرکز کنترل و پیشگیری از بیماریها تخمین زده سالانه 8000-18000 نفر در ایالت متحده به بیماری لژیونلوزیس مبتلا می شوند و 75 درصد موارد ابتلا گزارش نمی شوند. بنابراین آمارگزارش شده کمتر از میزان واقعی می باشد. آلودگی با لژیونلا به شکل تک گیر و همه گیر انتشار جهانی دارد وعوامل خطر ساز این بیماری با محیط و شرایط بیمار ارتباط دارد .

مخاطرات و اهمیت آلودگی لژیونلا :

باکتری لژیونلا یک باکتری هتروتروف است که برای رشد به آهن نیازمند است وبه طور طبیعی در منابع مختلف آب و شبکه آبرسانی و توده های بیوفیلم وجود دارد که از طریق آئروسل های سیستم های آبی منتشر وباعث پنومونی ریوی می گردد. از نظر اکولوژی باکتری لژیونلا در آب های طبیعی، سیستم های انسان ساخت و خاک های مرطوب یافت می شود. این باکتری درجه حرارت بین 20-50 درجه سانتیگراد و PH=8/5-5 رشد می کند درجه حرارت بهینه برای رشد این باکتری در محدوده 35-46 درجه سانتیگراد گزارش شده است. کنترل کیفیت آب مصرفی مراکز درمانی از نظر لژیونلا به دلیل پذیرش گروههای آسیب پذیر بسیار مهم است و اغلب کشور ها دستورالعمل های سخت گیرانه ای برای نظارت و کنترل لژیونلا تدوین و اجرا کرده اند. پارامتر های مستعد کننده رشد لژیونلا پنوموفیلا در شبکه توزیع آب بیمارستانی شامل شامل بزرگی وپیچیدگی شبکه توزیع آب ( وجود زمان ماند و نقاط کور ) ، وجود بیوفیلم میکروبی در سطوح داخلی لوله های شبکه توزیع و ویژگی های خاص ساختمان دیواره سلولی است که باکتری را در مقابل عوامل گند زدا حفاظت می کند. به طوریکه در اکثر مواقع عدم امکان نفوذ مواد ضد عفونی کننده به بیو فیلم ها باعث مقاومت باکتری لژیونلا می شود.

مطلب مرتبط : آزمایش میکروبی آب 

انتشار لژیونلا :

از نظر اکولوژی باکتری لژیونلا در آب های طبیعی مانند : آبهای زیر زمینی، دریاچه ها، رودخانه ها ونهرها هم چنین سیستم های انسان ساخت مانند سیستم های لوله کشی آب گرم ، سیستم های تهویه هوا، دوش های آب، دستگاههای بخار ساز و سیستم های آب پاش قطره ای ومخازن چرخشی آب وخاک یافت می شود. دوش آب حمام گاها سبب اپیدمی پنومونی لژیونلایی در بیمارستان ها می شود، دستگاههای بخور( که حاوی آب آشامیدنی شیرین است) ومخازن چرخشی آب می تواند محتوی لژیونلا باشد. عفونت های بیمارستانی را از آب شیر، نبولایزر، دوش حمام، دستگاه بخور آب ،آب بن ماری همچنين استخرهای آب درمانی ، سيستم های يونيت های دندانپزشکی، سيستم های دياليز و دستگاههای تنفس، سوند های بینی، مرطوب کننده ها وسایل درمانی تنفسی و استفاده از خورده های یخ مصرفی توسط بیماران جداسازی کرده اند.

بیماریزایی لژیونلا :

این باکتری قادر به ایجاد بیماری به صورت اسپورادیک و اپیدمیک می باشد از طرفی عفونت همزمان لژیونلا با سایر عوامل بیماریزای تنفسی مثل استرپتوکوک پنومونیه،هموفیلوس آنفولانزا ومایکوباکتریوم توبرکلوزیس می تواند مشکلات عدیده ای به بار آورد. اگر بیماران مبتلا به لژیونلا در مراحل اولیه بیماری تشخیص ومورد درمان قرار گیرند، خطر جدی آنها را تهدید نخواهد کرد. دوره درمان این بیماری 10-14 روز طول می کشد این در حالی است که افراد دارای سیستم ایمنی طبیعی پاسخ خوبی به درمان می دهند اما درمان در افراد با ضعف سیستم ایمنی به دلیل تاخیر در درمان و تشخیص دیر هنگام ، درمان آنها با شکست مواجه می گردد.

باکتری لژیونلا جداسازی شده از نمونه های محیطی می تواند 3 حالت داشته باشد:

1. باکتری زنده قابل کشت
2. باکتری زنده ولی غیر قابل کشت 3
3. باکتری های غیر زنده ولی سالم از نظر فیزیکی

روش های حذف لژیونلا :

شامل پرتوماورابنفش، کلر زنی و استفاده از کلرآمین ها وکاربرد شوک های حرارتی ویونیزاسیون مس- نقره می باشد. هر کدام از این روشها دارای محدودیت هایی نظیر کاهش راندمان و تولید محصولات جانبی می باشند. حذف باکتری لژیونلا در آب نیازمند 2-6 میلی گرم در لیتر کلر است که بسیار بالاتر از غلظت معمولی کلر در آب شرب است. داشتن زندگی همزیستی لژیونلا با برخی انگلها نظیر آمیب ها حذف آنها را تحت تاثیر قرار داده است . از طرفی برای کارکرد درست کلر لازم است که کلر در بیوفیلم نفوذ کند تزریق این مقدار از کلر که بتواند در بیوفیلم نفوذ کند به جز اینکه سبب تولید محصولات جانبی مثل تری هالومتان میگردد باعث ایجاد خورندگی درشبکه آبرسانی می شود ، که این امر به کلونیزاسیون لژیونلا کمک می کند.

مطلب مرتبط : کلر زنی آب استخر 

تاریخچه مطالعاتی لژیونلا در ایران :

در مطالعاتی که توسط گودرزی و همکاران صورت گرفت از 210 کودک مبتلا به عفونت های حاد تنفسی ، 12 نمونه از نظر ابتلا مثبت بودند . در مطالعه دیگری که توسط مرادزاده بر روی منابع آب محیطی وبیمارستان شهر اهواز انجام شد ، نشان داده شد 15% از مجموع 100 نمونه از نظر حضور لژیونلا مثبت می باشد که فراوانی آنها در نمونه های بیمارستانی 8% و در نمونه های محیطی 7% بوده است . هم چنین احمدی جلالی مقدم و همکاران در مطالعاتی بر روی فراوانی لژیونلا در شیر آب سرد و گرم آب انکوباتورهای بخش نوزادان بیمارستان های گیلان نشان دادند حدود 8.5 درصد نمونه ها از نظر حضور لژیونلا مثبت بودند که 1/11 درصد از آب انکوباتور ها و 5.8 درصد از آب های شیر سرد و گرم جداساسازی شدند. طی مطالعات دیگری که اسماعیلی و همکاران بر روی آب مصرفی بیمارستان های تهران انجام دادند ، نشان داده شد از 32 بیمارستان 22 بیمارستان (% 7/68) به لژیونلا آلوده بودند.

برای مطالعه مقاله مزوزوم چیست در آسالب کلیک کنید.

روش های تشخیصی:

کشت متداول ترین ترین روش آزمایشگاهی نظارت بر آب های محیطی است و برای جداسازی و شمارش میکروبی مناسب است .کشت باکتری لژیونلا هنوز روشی روتین در شناسایی باکتری به شمار می رود ولی با توجه به مشکلات روش کشت از جمله حساسیت کمتر آن و با توجه به اینکه جهت جداسازی لژیونلا از نمونه ها مدت زمان طولانی (حداقل 7 روز) نیاز می باشد، هم چنین زمان تشخیص طولانی درمان را در بیماران مبتلا با تاخیر روبه رومیکند.

به طور معمول وجود تعدادcfu/ml 10⁴-10⁵ لژیونلا پنوموفیلا برای انسان خطرناک است اطلاعات اپیدمیولوژیکی نشان می دهد که بیش ترین موارد اپیدمی با این تعداد لژیونلا در آب اتفاق می افتد نکته مهم این است که لژیونلا ها در شرایط خاصی از جمله مواجهه با فقر غذایی ، استرس، فشار اسمزی و استرس اکسیداتیو (کلرزنی آب) به حالتی در می ایند که هنوز زنده بوده اما غیر قابل کشت هستند که اصطلاحا Viable But Non Culturable (VBNC) نامیده می شوند که از نظر بهداشتی بسیار خطرناک می باشند زیرا می توانند قابلیت رشد خود را در شرایط مناسب باز یابند. امروزه روش های پیشرفته تری از جمله PCR مورد استفاده قرار میگیرند که محدودیت های کشت را ندارد. آزمون PCR به لحاظ مدت زمان آزمایش ، سادگی و قابلیت شناسایی باکتری مرده دارای مزیت است. در این روش بخشی از توالی اختصاصی یک ژن انتخاب شده و با تکثیر این توالی ، لژیونلا ردیابی می شود. بنابراین مشکل مربوط به نتایج منفی کاذب که در روش کشت با آن رو به رو بوده ایم (50-60%) را نخواهیم داشت . مطالعاتی که در ایران بر روی لژیونلا انجام گردید نشان داده است که در تشخیص لژیونلا به روش کشت و روش PCR, اختلاف معنا داری وجود دارد ونتایج منفی کاذب حاصل از کشت غیر قابل چشم پوشی می باشد. ما در آزمایشگاه آزمون سلامت آسا با بکارگیری جدیدترین کیت ها و تجهیزات به روز دنیا با انتخاب توالی اختصاصی ژن هدف ، قادر به ردیابی نمونه لژیونلا هستیم.

منابع وماخذ :

1-احمدی جلالی مقدم م، هنرمند ح، سلطانی تهرانی ب ، نوجوان م، اسفرم مشگین شهر. »فراوانی لژیونلا پنوموفیلا در شیر آب سرد و گرم ومخزن آب انکوباتورهای بخش نوزادان بیمارستان های گیلان«. مجله دانشگاه علوم پزشکی مازندران ، دوره بیست و دوم ، اسفند 1393 : 321-312.

2-صفایی م،غنی زاده ق، اسماعیلی د. »کاربرد فرایند ازون زنی در حذف لژیونلا پنوموفیلا در آب«. دو ماهنامه علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه، سال نوزدهم، شماره چهارم، مرداد و شهریور 94 : 197-206.

3-گودرزی ح، سید جوادی س، گودرزی م. »شناسایی لژیونلا پنوموفیلا از نمونه های خلط بیماران مبتلا به پنومونی با روش کشت ، ایمونوفلورسانس مستقیم وPCR « مجله پژوهشی دانشکده پزشکی شهید بهشتی . دوره 35، شماره 2، تابستان1390: 119-124.

4-مراد زاده م، موسویان م. »بررسی میزان آلودگی منابع آب محیطی و بیمارستان های شهر اهواز به باگتری لژیونلا، با استفاده از کشت وتکثیر ژن 16S rRNA « مجله تازه های بیوتکنولوژی سلولی- مولکولی ، دوره ششم، شماره بیست و سوم ، تابستان 1395: 47-52.

Refrence:

1. Allen JG, Myatt TA, MacIntosh DL, Ludwig JF, Minegishi T, Stewart JH, et al. Assessing risk of health care–

2. Borella P, Montagna MT, Stampi S,Stancanelli G, Romano-Spica V, Triassi M,et al. Legionella contamination in hot water of Italian hotels. Appl Environ Microbiol 2005; 71(10): 5805-5813. PMID: 16204491

3. Carratala J, Garcia-Vidal C. An update on Legionella. Curr Opin Infect Dis. 2010;23(2):152-7.

4. Declerck P, Behets J, van Hoef V, Ollevier F. Replication of Legionella pneumophila in floating biofilms. Curr

Microbiol. 2007;55(5):435-40.

5. Gruas C, Llambi S, Arruga MV. Detection of Legionella spp. and Legionella pneumophila in water samples of

Spain by specific real-time PCR. J Arch Microbiol. 2014;196(1):63-71.

6. Helbig JH, Bernander M, Castellani-Pastoris M, Etienne K, Gaia V, Lauwers S, et al. PanEuropcan study

On culture-proven Legionnaire's disease: distribution of Legionella Pneumophila serogroups and monoclonal subgroups.m Eur J Clin MicrobInfectDis 2002; 21:710-716.PMID:12415469

7. Jalila T, Benchekroun MN, Ennaji MM, Mekkour M, Cohen N. Nosocomial Legionnaires’ disease: Risque and

prevention. Int J Environ Sci Res. 2012; 1(3):72-85.

8. Kim B, Anderson J, Mueller S, Gaines W, Kendall A. Literature reviewe-efficacy of various disinfectants

against Legionella in water systems. J Water Res. 2002;36(18):4433-44.

9 Lau H, Ashbolt N. The role of biofilms and protozoa in Legionella pathogenesis: implications for drinking

water. J Appl Microbiol. 2009;107(2):368-78.

1. Motaharinia Y, Shapuri R,Rahnama M, Aliramaie MR, Rahmani MR, Rezaie MA. [Isolation of legionella

pneumophila from environment and water system samples and evaluation of immuno-protective efficiency of

its whole killed cell in mice model (Persian)]. Sci J Kurdistan Uni Med Sci. 2010;15(2):70-8.

11. Westerlaken M. Biological mechanisms behind Legionella control. 1 St ed. Science Shop for Biology. Utrecht University. 2006;1-29

12. Zhang Z, McCann C, Hanrahan J, Jencson A, Joyce D, Fyffe S, et al. Legionella control by chlorine dioxide in

hospital water systems. J AWWA. 2009;101(5).117-127.

.