روزانه میلیون‌ها نفر از محصولات لبنی در وعده‌های غذایی خود استفاده می‌کنند.  شیر و فرآورده‌های لبنی در بین غذاهای متعدد با منشاء حیوانی و گیاهی از جایگاه خاصی برخوردار هستند. وجود مقدار کافی پروتئین، چربی، اسیدهای آمینه ضروری، کلسیم و فسفر اهمیت ارزش تغذیه‌ای شیر و فرآورده‌های لبنی را دو چندان کرده است.

اهمیت‌ انجام آزمون‌های میکروبی شیر:

شیر به دلیل رطوبت کافی، pH نزدیک به خنثی و غنی بودن مواد غذایی محیط مناسبی برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌هاست . در ضمن منبع غنی از انرژی در شکل‌های مختلف نظیر قند، شیر(لاکتوز)، ترکیبات نیتروژنی مانند پروتئین ها، اسیدهای آمینه و…. می‌باشد. بسیاری از ترکیبات ضدمیکروبی (لاکتوپراکسیداز، آگلوتنین) در شیر تازه دوشیده شده وجود دارند، اما به علت تخمیر قند و تولیداسید توسط باکتری‌های معمول شیرخام به سرعت بی‌اثر می‌شوند. بنابراین بسیاری از میکروارگانیسم‌ها قادر به رشد در چنین محیطی هستند.

منشاء وجود میکروارگانیسم‌ها در شیر:

البته گروهی از این میکروارگانیسم‌ها نظیر برخی از گونه‌های باکتری‌های اسید لاکتیک مفیدند و برای تولید فرآورده‌های مختلف شیری مورد استفاده قرار می‌گیرند.

این باکتری‌های لاکتیکی عمدتاً از کربوهیدراتهایی نظیر لاکتوز استفاده می‌کنند و اسیدلاکتیک تولید می‌کنند. این میکروارگانیسم‌ها نظیر لاکتوکوکس و لاکتوباسیلوس هستند. لاکتوکوکس لاکتیس زیر گونه لاکتیس و کروموریس به سرعت به ویژه در دمای حدود 20 درجه سانتی گراد رشد می‌کنند. بنابراین شیر در صورتی‌ که سرد نشود ترش می‌شود. البته قبل از این‌که شیر کاملاً ترش شود برای فرآوری مناسب نیست.باکتریهای اسیدلاکتیک مزوفیل توسط پاستوریزاسیون(“15/ 72ºc)و حتی ترمیزاسیون ( “15/ 65ºc ) می‌میرند، اما انواع ترموفیل نظیر استرپتوکوکوس تروفیلوس تحت چنین شرایطی از بین نمی‌روند و البته لازم به ذکر است که برخی از استرپتوکوک‌هایی که به ویژه در اثر بیماری ورم پستان افزایش می‌یابند بیماری‌زا هستند.

انواع میکروارگانیسم‌های موجود در شیر:

متأسفانه کیفیت بهداشتی این فرآورده‌ها در اثر حضور پاتوژن‌های میکروبی می‌تواند تغییر یابد. از مهم‌ترین باکتری‌های پاتوژن در شیر می‌توان به استافیلوکوکوس اورئوس، سالمونلا، کلیفرم‌هایی مانند اشریشیا کلی، لیستریا، بروسلا و باسیلوس سرئوس اشاره کرد.

اشریشیا کلی:

باکتری گرم منفی از خانواده‌ی انتروباکتریاسه می‌باشد که برخی سویه‌های آن عامل گاستروانتریت و دیسانتری می‌باشد. ازآنجا که این باکتری فلور نرمال روده انسان و حیوانات می‌باشد، وجود آن در خارج از روده نشان دهنده‌ی آلودگی با مدفوع می‌باشد.

در صورت وجود این باکتری در شیر و عدم پاستوریزاسیون صحیح، اشریشیا کلی باعث ایجاد بیماری می‌گردد.مکانیسم بیماری‌زایی به این صورت می‌باشد که سم باکتری به سلول های اپیتلیال روده متصل می‌گردد و با فعال کردن آدنیل سیکلاز، سطح CAMPبالا رفته و منجر به از دست رفتن آب و الکترولیت‌های بدن می‌شود. با جوشاندن شیر و یا فرآیند صحیح پاستوریزاسیون این باکتری از بین خواهد رفت.

استافیلوکوکوس اورئوس:

باکتری های گرم مثبت و مقاوم به حرارت هستند و در شرایط میکروآیروفیلیک رشد می‌کنند. وجود استاف اورئوس در شیر می‌تواند نشان دهنده‌ی التهاب چرکی در پستان گاو باشد که از این طریق به شیر راه یافته و سبب آلودگی آن می‌گردد.

انتروتوکسین استاف اورئوس عامل ایجاد بیماری‌زایی در انسان می‌باشد.مسمومیت غذایی دوره ی نهفتگی یک تا شش ساعته داشته و علائمی چون دل درد، تهوع و استفراغ به همراه دارد. اثر استفراغ‌آوری انتروتوکسین به علت تحریک دستگاه اعصاب مرکزی پس از اثر سم روی گیرنده‌های عصبی روده می‌باشد.

باسیلوس سرئوس:

باسیل‌های گرم مثبت اسپورزایی هستند که در آب و خاک یافت می‌شوند و از آنجایی که اسپور تولید می‌کنند می‌توانند سال‌ها در محیط زنده بمانند.

مسمومیت با باسیلوس سرئوس به دو صوررت می‌باشد: بیماری اسهال و بیماری استفراغ

در بیماری اسهال دوره‌ی کمون 1 تا 24 ساعت می‌باشد و در بیماری استفراغ دوره‌ی کمون 1 تا 5 ساعت است.

توکسین عامل بیماری استفراغ پروتئین نامحلول درآب می‌باشد که به اسید و حرارت مقاوم است و حرارت 126 درجه را 90 دقیقه تحمل می‌کند. توکسین عامل اسهال پروتئینی حساس به حرارت است که در دمای 56 درجه به مدت 5 دقیقه از بین می‌رود. این سموم با اتصال به سلول‌های اپیتلیال باعث تخریب غشای سلولی گشته و ایجاد بیماری می‌کند.

میکرو ارگانیسم‌های سرماگرا (سایکروفیل‌ها):

باکتری‌های سرمادوست به دلیل این‌که قدرت رشد و فعالیت در دمای پایین را دارند با دارا بودن این قابلیت در فساد مواد غذایی در یخچال نقش به سزایی دارند.این باکتری‌ها با تولید انواع آنزیم‌های خارج سلولی باعث تغییر ترکیبات مواد غذایی شده و در نتیجه موجب فساد آن‌ها می‌گردد. تا قبل از فرآوری شیر در صورت وجود این باکتری‌ها در آن، کیفیت شیر تا حد زیادی پایین آمده و حتی ممکن است غیر قابل مصرف گردد.

بروسلا:

باکتری عامل تب مالت می‌باشد که به صورت انگل اجباری داخل سلولی زندگی می‌کند و انسان‌ها و حیوانات را آلوده می‌کند. علائم بالینی با تب، ضعف، درد و تعریق همراه می‌باشد.

شایع‌ترین روش آلودگی از خوردن شیرآلوده و فرآورده های لبنی آلوده از راه دستگاه گوارشی، راه مخاط(ترشحات) پوست(تماس با بافت حیوان آلوده) می‌باشد.این باکتری می‌تواند به مدت 10 روز در شیر زنده بماند.

مکانیسم بیماری‌زایی بروسلا به این صورت است که در تمام میزبان‌های خود رشد داخل سلولی دارد و پس از آلوده کردن سیستم رتیکولواندوتلیال سبب باکتریمی می‌گردد. بیماری‌زایی بروسلا اغلب در توانایی این باکتری در وارد شدن و زنده ماندن و تکثیر در سلول های فاگوسیتوز (ماکروفاژها) می‌باشد.این باکتری به طحال، کبد، مغزاستخوان، غدد لنفاوی و کلیه ها حمله می‌کند و سبب تخریب بافتی می‌گردد.

سالمونلا:

باکتری‌های گرم منفی از خانواده ی انتروباکتریاسه هستند و عامل بیماری سالمونلوزیز که به عنوان یکی از عوامل اصلی ایجاد کننده مسمومیت‌‌های غذایی مهم، مطرح می‌باشند.

علائم بالینی با گاسترو انتریت و اسهال بروز پیدا می‌کند. در یکی از بررسی های به دست آمده نشان داده شده که شیر خام دارای بیشترین میزان آلودگی به سالمونلا در مقایسه با سایر فرآورده‌های لبنی است.

بیماریزایی سالمونلا بدین صورت است که می‌تواند در درون ماکروفاژها زنده بماند و به تکثیر خود ادامه دهد. سالمونلا به بافت هدف که سلول‌های M در پلاک پی یر حمله کرده و با تولید انتروتوکسین و اتصال آن به گانگلیوزید GM1 سبب افزایش سطح cAMP شده و باعث ترشح آب و الکترولیت‌ها از بدن می‌شود.

لیستریا:

باکتری‌های گرم مثبت میکروآیروفیلیک هستند که ایجاد بیماری لیستریوزیز در حیوان و انسان می‌کنند. این باکتری به صورت وسیعی در آب و خاک و مواد غذایی یافت می‌شود. مقاوت در برابر سرما، خشکی و پایداری در برابر فشارهای اسمزی باعث افزایش بقا و پراکندگی آن شده است. همچنین این باکتری با قابلیت اتصال زیاد به سطوحی چون استیل و شیشه با تشکیل بایوفیلم می‌تواند از طریق اتصال به ظروف در یخچال گسترش یابد. این باکتری در فرآیند ناقص پاستوریزاسیون از بین نمی‌رود.

این باکتری پس از خوردن غذاهای آلوده از جمله شیر از طریق دستگاه گوارش وارد شده و از طریق پروتئین سطحی خود بر روی سطح سلول‌های اپیتلیال اتصال یافته و وارد سلول می‌گردد و با مکانیسم فرار از سیستم ایمنی از سلولی به سلول دیگر حرکت کرده و تکثیر می یابد و عوارضی چون سپتی سمی، سقط جنین، بیماری‌های ثانویه در افراد دارای نقص سیستم ایمنی و مننژیت را ایجاد می‌کند.

روش‌های بررسی میکروبیولوژیک شیر:

برای همگی عوامل پاتوژن روش‌های تشخیصی کشت و مولکولی قابل انجام می‌باشد ولی در حال حاضر استاندارد طلایی روش کشت می‌باشد که با توجه به استانداردهای مربوط به هرکدام از عوامل پاتوژن می‌توان آن‌ها را جداسازی کرد.

– رنگ آمیزی گرام:

روش کار:

رقت 1/0 از شیر را تهیه و گسترش را آماده کرده و فیکس می‌کنیم . لام را حدود 1 دقیقه در گزیلول (عامل حذف چربی‌های شیر) قرار داده و بعد از تبخیر گزیلول و خشک شدن لام، رنگ آمیزی گرام را انجام و تشخیص می‌دهیم. در لام تهیه شده به دنبال:

1- میکرو کوکسی

2- لاکتو باسیلوس اسیدوفیلوس

باسیل های نسبتا بلند، گرام مثبت

3- استرپتوکوکوس لاکتوس ،کوکسی های زنجیری، گرام مثبت

4- میکروباکتریوم لاکتیوم فاقد اسپور، مقاوم به دما

– روش آزمایش احیای متیلن بلو یا تست ردوکتاز:

حیات تمام موجودات از جمله میکروارگانیسم‌ها وابسته به متابولیسم است، عمده واکنش‌هایی که در متابولیسم رخ می‌دهد ، اکسیداسیون و احیا است. برخی از ترکیبات شیمیایی مثل برخی از رنگ‌ها از جمله متیلن بلو می‌توانند در شرایط آزمایشگاهی در نقش پذیرنده‌های الکترون باشند که وقتی احیا می‌شوند بی‌رنگ می‌شوند.

اگر به نمونه شیر مشکوکی متیلن بلو اضافه کنیم و بی رنگ شود، احیای متیلن بلو دلیل بر پذیرش الکترون است و الکترون‌هایی در میکروارگانیسم‌های شیر وجود دارد که باعث اکسیداسیون و احیا می‌شود و متیلن بلو نیز احیا می‌شود.

روش کار:

5 لوله به شرح زیر تهیه می کنیم:

لوله اول 9 سی سی شیر + 1 سی سی آب مقطر + 1 سی سی متیلن بلو = رقت: 0.9

لوله دوم 8 سی سی شیر + 2 سی سی آب مقطر + 1 سی سی متیلن بلو = رقت 0.8

لوله سوم 7 سی سی شیر + 3 سی سی آب مقطر + 1 سی سی متیلن بلو = رقت 0.7

لوله چهارم 6 سی سی شیر + 4 سی سی آب مقطر + 1 سی سی متیلن بلو = رقت 0.6

لوله پنجم 5 سی سی شیر + 5 سی سی آب مقطر + 1 سی سی متیلن بلو = رقت 0.5

لول‌ ها آبی رنگ می شوند و سر لوله ها را با پارافیلم می‌بندیم. زمان بی‌رنگ شدن متیلن بلو در لوله اول ملاک قضاوت است. سرعت بی‌رنگ شدن متیلن بلو ارتباط مستقیم با تعداد و فعالیت میکروارگانیسم‌های شیر دارد. اگر در حالتی لوله دوم بی رنگ نشد ولی لوله سوم بی‌رنگ شد، در می یابیم که آزمایش درست انجام نگرفته است. باید لوله ها به ترتیب بی‌رنگ شوند.

1. اگر شیر در لوله اول در زمانی بیش از 5:30 ساعت بی‌رنگ شود، تعداد باکتری‌ها در 1 سی سی از شیر کمتر از 500،000 است. شیر بسیار خوب است.

2. اگر شیر در لوله اول در زمانی بین 2 تا5:30 ساعت بی رنگ شود، تعداد باکتری‌ها در 1 سی سی از شیر بیش از 500،000 و کمتر از 4 میلیون است. شیر قابل قبول است.

3. اگر شیر در لوله اول در زمانی بین 2 ساعت تا 20 دقیقه بی‌رنگ شود، تعداد باکتری‌ها در 1 سی سی از شیر بین 4 تا 20 میلیون است. شیر بد است.

4. اگر شیر در لوله اول در زمانی کمتر از 20 دقیقه بی رنگ شود‌، تعداد باکتری ها در 1 سی سی از شیر بیش از 20 میلیون است. شیر غیر قابل مصرف است.

– روش بررسی بار میکروبی شیر  با شمارش میکرو ارگانیسم ها :

روش کار:

در این روش برای شیر پاستوریزه رقت 0.01 و برای شیر خام رقت 0.0001 تهیه می‌کنیم. سپس کشت می‌دهیم و با شمارش پرگنه‌ها به قضاوت می‌پردازیم.

اندازه گیری بار میکروبی شیر Total Count:

براي تست بار ميكروبي شیر روشهاي مختلفي وجود دارد روش‌هايي مثل :

1. روش مستقيم : Direct microscopic count

2. روش اسپكتروفتومتری

3. روش احياء رنگ

4. روش كشت در محيط جامد 

 روش مستقيم :

در اين روش ما يك ميدان مشخصي را در زير ميكروسكوپ تعيين مي‌كنيم كه سطح آن كاملا براي ما تعيين شده است. بعد مقدار مشخص از ماده غذايي را كه حتما بايستي به صورت محلول شفاف باشد بر روي آن سطح تعبيه شده بر روي لام گسترش می‌دهیم و در زير ميكروسكوپ تعداد باكتريها را با چشم مي‌شماریم.

مزايا : سرعت روش بالاست.

 عيوب : دقيق نيست، خسته كننده است و گاهاً ذرات غذا به جاي پيكره باكتري اشتباه گرفته مي‌شوند .

اسپكتروفتومتري (جذب رنگي)

در اين روش ميزان بار ميكروبي بر اساس كدورتي كه در محيط ايجاد مي‌كند تعيين مي‌شود. چرا كه هر چقدر تعداد باكتري زياد باشد كدورت بيشتري ايجاد خواهد كرد  و در نتيجه نور بيشتري را به خود خواهد گرفت و از اين طريق مي‌شود يك برآورد كلي ولي نه دقيق از بار ميكروبي به‌دست آورد .

مزايا : سرعت روش بالاست.

 عيوب : بايد ماده غذايي مايع و شفاف باشد و همچنین نتایج دقيق هم نيست .

روش احياء رنگ :

يك روش كيفي است که تخميني از بار ميكروبي را به ما نشان مي‌دهد. براي انجام اين سري از آزمايشات از يك سري رنگ‌ها استفاده مي‌شود كه اين رنگ‌ها تحت تأثير فعاليت باكتري‌ها احيا شده و تغيير رنگ مي‌دهند. بر اساس اين‌كه زمان تغيير رنگ چه زمانی  اتفاق مي‌افتد مي‌توانيم در مورد بار ميكروبي قضاوت كنيم. (بار ميكروبي بيشتر تغيير رنگ زودتر) از اين رنگ‌ها مي‌شود به متيلن بلو و رزازورين اشاره كرد .

متيلن بلو —احيا شده —-لكو متيلن بلو

رزازورين — احيا شده —- رزارونين

كشت در محيط جامد: ( كشت سطحي – كشت عمقي )

اين روش بر اساس تعيين رقت‌هاي مختلف  از ماده غذايي و كشت آنها در محيط‌هاي جامد باكتريايي و نهايتاً شمارش كلني‌هاي رشد كرده می‌باشد. روش بسيار دقيق و مرجع محسوب می‌شود و در تحقيقات علمی از اين روش استفاده مي‌كنند .

روش كار احياي رنگ :

سه لوله آزمايش در نظر مي‌گيريم كه پنجاه سي سي گنجايش داشته باشد و بهتر است كه استريل باشد.

در لوله اولي 10 سي سي دومي 20 سي سي , سومي 40 سي سي شير مي‌ريزيم و بعد متيلن بلو

در لوله اولي 25/0 سي سي دومي 5/0 سي سي , سومي 1 سي سي اضافه مي‌كنيم .

محتويات را خوب هم مي‌زنيم و بعد در داخل بن ماري 37 الي 38 درجه سانتيگراد مي‌گذاريم هر ربع ساعت آن‌ها را چك کرده تا بتوانیم زمان بي‌رنگ شدن متيلن بلو را  يادداشت كنيم. در اينجا سه قانون وجود داردد.

1. اگر متيلن بلو در كمتر از يك ساعت بي‌رنگ شد، بار ميكروبي زياد است .

2. اگر بين 1الي 3 ساعت بي‌رنگ شد، كيفيت شير قبل قبول است .

3. اگر بيشتر از 3 ساعت طول كشيد تا بيرنگ شود، كيفيت آن خيلي خوب است .

روش كار كشت در محيط جامد : Standard plate countor

ما در اين روش 5 لوله آزمايش داريم و ماده غذاييمان هم در داخل يك ظرف ديگر مي‌باشد. در داخل هر كدام از لوله‌هاي آزمايش 9 سي سي ماده رقيق كننده مي‌ريزيم و بعد از ماده غذايي يك سي سي به لوله اول ريخته و بهم مي‌زنيم. از لوله اول 1 سي سي به لوله دوم مي‌ريزيم و همين كار را تا آخرين لوله انجام  مي‌دهيم  و در انتها از هر لوله يك محيط كشت تهيه مي‌كنيم . (محيط كشت جامد) 

  مراحل انجام آزمایش میکروبی شیر:

مواد و وسایل مورد نیاز:

1)سرم فیزیولوزی 8.5 گرم نمک در یک لیتر آب مقطر 2) نمونه شیر  3) پیپت استریل  4) لوله آزمایش  5) پلیت استریل 6) محیط کشت پلیت کانت آگار 7) اتو کلاو  8) فور

 در 7 لوله آزمایش مقدار 9 میلی لیتر سرم فیزیولوزی ریخته و اتو کلاو می‌نماییم. پس از سرد شدن 1 میلی لیتر از نمونه شیر را در لوله اول می‌ریزیم. سپس به میزان 1 میلی لیتر از لوله اول برداشته در لوله دوم ریخته و به همین ترتیب تا لوله آخر ادامه داده تا رقت‌های مورد نظر ایجاد شود. جهت  شمارش بار میکروبی شیر یا Total Count   از هر کدام از رقت‌ها یک میلی لیتر به طور جداگانه برداشته و  بصورت Pure Plate کشت می‌دهیم (با پیپت استریل یک میلی لیتر برداشت نموده ودر پلیت استریل ریخته و  داخل هر پلیت از محیط کشت استریل شده پلیت کانت آگار که نزدیک به انعقاد می‌باشد با دمای حدود50-40 درجه سانتی گراد می ریزیم) و در دمای 31 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز انکوبه می‌نماییم. تعداد کلنی‌ها را شمرده و میانگین شمارش شده را در رقت‌های مختلف محاسبه و به‌عنوان بار میکروبی شیر Total Count منظور می‌نماییم.

رفرنس‌ها:

1. مطالعه وشناسایی مولکولی بروسلا در محصولات لبنی- مجله بیوتکنولوژی سلولی و ملکولی- سال 92

2. جداسازی و بررسی فاکتورهای ویرولانس گونه های سالمونلا درشیر و فرآورده های لبنی مجله میکروب شناسی ایران – سال93

3. ردیابی ژن های حدت و انترو توکسین در سالمونلا جدا شده از گوشت و تخم مرغ با روش مولکولی –مجله میکروب شناسی موادغذایی-سال 94

4. بروسلا،بیماریزایی،واکنش سسیستم ایمنی و واکسن-مجله دانشکده پزشکی اصفهان-سال 93

5. فراوانی گونه های لیستریا در شیرخام و فراورده های لبنی سنتی-مجله علوم تغذیه و صنایع غذایی ایران-سال 94

6. مقایسه دو روش کشت و مولکولی در شناسایی اشریشیا کلی در شیر-مجله علمی پژوهشی بیوتکنولوژی-سال 90

7. بررسی میزان آلودگی شیر خام به استافیلوکوکوس اورئوس-فصلنامه علمی پژوهشی بیولوژی کاربرددی

8. بررسی آلودگی میکروبی اواع شیر و فرآورده های لبنی پاستوریزه – مجله ی دنیای میکروب شناسی – سال 91

9. جداسازی و شناسایی باسیلوس سرئوس در شیر – مجله ی علوم زیستی لاهیجان

10. میکروب شناسی جاوتز