مروری بر جستجو و ردیابی لژیونلا به روش PCR

معرفی باکتری لژیونلا: لژیونلاها باسیل‌های کوچک، هوازی و گرم منفی به ابعاد 2×7/0-5/0 میکرون هستند که توانايي بقاء در آب‌هاي با درجه حرارت و  pH گوناگون، موادمغذي و اكسيژن را دارند. باکتری لژیونلا عامل دو نوع بیماری لژیونلوزیس و تب پونتیک با شدت و علائم کلینیکی متفاوت است که دارای 51 گونه و 72 سروگروپ می‌باشد. گونه پنوموفیلا 15 سروگروپ دارد و 85 درصد عفونت‌های انسانی به سروگروپ‌های 1،4،6 ارتباط دارد. هم چنین 2 تا 15 درصد از موارد بستری پنومونی اکتسابی ریوی و دومین عامل نیاز به مراقبت های ICU در میان بیماران مبتلا به پنومونی اکتسابی ریوی به گونه لژیونلا مرتبط است. هر چند 20 گونه از این باکتری می‌تواند عامل عفونت و بیماری در انسان باشد اما لژیونلا پنوموفیلا شایع‌ترین گونه عامل عفونت در انسان گزارش شده است. این باکتری گرم منفی به صورت هم‌زیستی با آمیب در منابع آبی زندگی می‌کند که این شرایط باکتری را در برابر اوضاع نامساعد محیطی محافظت می‌کند. از طرفی داشتن دیواره سلولی پیچیده متشکل از دو غشاء لیپیدی و یک لایه پپتیدوگلیکان، ساختار غشاء بیرونی باکتری را در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها و مواد ضد عفونی کننده محافظت می‌کند.

تاریخچه و اپیدمیولوژی :

اولین شیوع عفونت لژیونلا در حدود 40 سال پیش در نظامیان آمریکا باعث مرگ 34 لژیونر نظامی گردید. بعد از شناسایی این باکتری مشخص شد که آلودگی با لژیونلا انتشار جهانی دارد. مرگ و میر ناشی از لژیونلا پنوموفیلا به علت استنشاق آئروسل‌های آلوده 5 تا 40 درصد بر آورد گردید، که این میزان در بین بیماران بستری شده در بیمارستان تا بیش از 40 درصد گزارش شده است. بر اساس گزارش‌های مرکز کنترل بیماری‌ها، شیوع لژیونلا در محیط‌های بیمارستانی بین 25-40 درصد می‌باشد. در اروپا به طور معمول به ازای یک میلیون جمعیت، 2/8 نفر به بیماری لژیونلوزیس دچار می‌شوند. مرکز کنترل و پیشگیری از بیماری‌ها تخمین زده سالانه 8000-18000 نفر در ایالت متحده به بیماری لژیونلوزیس مبتلا می‌شوند و 75 درصد موارد ابتلا گزارش نمی‌شوند. بنابراین آمار گزارش شده کمتر از میزان واقعی می‌باشد. آلودگی با لژیونلا به شکل تک‌گیر و همه‌گیر، انتشار جهانی دارد و عوامل خطر ساز این بیماری با محیط و شرایط بیمار ارتباط دارد.

مخاطرات و اهمیت آلودگی لژیونلا :

باکتری لژیونلا یک باکتری هتروتروف است که برای رشد به آهن نیازمند است و به طور طبیعی در منابع مختلف آب و شبکه آبرسانی و توده‌های بیوفیلم وجود دارد که از طریق آئروسل‌های سیستم‌های آبی منتشر و باعث پنومونی ریوی می‌گردد. از نظر اکولوژی باکتری لژیونلا در آب‌های طبیعی، سیستم‌های انسان ساخت و خاک‌های مرطوب یافت می‌شود. این باکتری در درجه حرارت بین 20-50 درجه سانتیگراد و PH=8/5-5 رشد می‌کند. درجه حرارت بهینه برای رشد این باکتری در محدوده 35-46 درجه سانتیگراد گزارش شده است. کنترل کیفیت آب مصرفی مراکز درمانی از نظر لژیونلا به دلیل پذیرش گروه‌های آسیب پذیر بسیار مهم است و اغلب کشورها دستورالعمل‌های سخت‌گیرانه‌ای برای نظارت و کنترل لژیونلا تدوین و اجرا کرده‌اند. پارامترهای مستعد کننده رشد لژیونلا پنوموفیلا در شبکه توزیع آب بیمارستانی  شامل بزرگی و پیچیدگی شبکه توزیع آب (وجود زمان ماند و نقاط کور)، وجود بیوفیلم میکروبی در سطوح داخلی لوله‌های شبکه توزیع و ویژگی‌های خاص ساختمان دیواره سلولی است که باکتری را در مقابل عوامل گند‌زدا حفاظت می‌کند. به طوری‌که در اکثر مواقع عدم امکان نفوذ مواد ضد عفونی کننده به بیو فیلم‌ها باعث مقاومت باکتری لژیونلا می‌شود.

مطلب مرتبط : آزمایش میکروبی آب 

انتشار لژیونلا :

از نظر اکولوژی باکتری لژیونلا در آب‌های طبیعی مانند: آب‌های زیر زمینی، دریاچه‌ها، رودخانه‌ها، نهرها و همچنین سیستم‌های انسان ساخت مانند سیستم‌های لوله کشی آب گرم‌، سیستم‌های تهویه هوا، دوش‌های آب، دستگاه‌های بخار ساز و سیستم‌های آب‌پاش قطره‌ای و مخازن چرخشی آب و خاک یافت می‌شود. دوش آب حمام گاهاً سبب اپیدمی پنومونی لژیونلایی در بیمارستان‌ها می‌شود. دستگاه‌های بخور( که حاوی آب آشامیدنی شیرین است) و مخازن چرخشی آب می‌تواند محتوی لژیونلا باشد. عفونت‌های بیمارستانی را از آب شیر، نبولایزر، دوش حمام، دستگاه بخور آب، آب بن ماری همچنين استخرهای آب درمانی، سيستم‌های يونيت‌های دندانپزشکی، سيستم‌های دياليز و دستگاه‌های تنفس، سوندهای بینی، مرطوب کننده‌ها، وسایل درمانی تنفسی و استفاده از خورده‌های یخ مصرفی توسط بیماران جداسازی کرده‌اند.

بیماریزایی لژیونلا :

این باکتری قادر به ایجاد بیماری به صورت اسپورادیک و اپیدمیک می‌باشد. از طرفی عفونت همزمان لژیونلا با سایر عوامل بیماری‌زای تنفسی مثل استرپتوکوک پنومونیه، هموفیلوس آنفولانزا و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می‌تواند مشکلات عدیده‌ای به بار آورد. اگر بیماران مبتلا به لژیونلا در مراحل اولیه بیماری تشخیص مورد درمان قرار گیرند، خطر جدی آنها را تهدید نخواهد کرد. دوره درمان این بیماری 10-14 روز طول می‌کشد این در حالی است که افراد دارای سیستم ایمنی طبیعی پاسخ خوبی به درمان می‌دهند اما درمان در افراد با ضعف سیستم ایمنی به دلیل تأخیر در درمان و تشخیص دیر هنگام، درمان آن‌ها با شکست مواجه می‌گردد.

باکتری لژیونلا جداسازی شده از نمونه‌های محیطی می‌تواند 3 حالت داشته باشد:

1. 1. باکتری زنده قابل کشت
   2. باکتری زنده ولی غیر قابل کشت 
   3. باکتری های غیر زنده ولی سالم از نظر فیزیکی

روش های حذف لژیونلا :

شامل پرتو ماورابنفش، کلر زنی و استفاده از کلرآمین ها و کاربرد شوک‌های حرارتی  ویونیزاسیون مس- نقره می‌باشد. هر کدام از این روش‌ها دارای محدودیت‌هایی نظیر کاهش راندمان و تولید محصولات جانبی می‌باشند. حذف باکتری لژیونلا در آب نیازمند 2-6 میلی گرم در لیتر کلر است که بسیار بالاتر از غلظت معمولی کلر در آب شرب است. داشتن زندگی همزیستی لژیونلا با برخی انگل‌ها نظیر آمیب‌ها حذف آنها را تحت تأثیر قرار داده است. از طرفی برای کارکرد درست کلر لازم است که کلر در بیوفیلم نفوذ کند. تزریق این مقدار از کلر که بتواند در بیوفیلم نفوذ کند به جز اینکه سبب تولید محصولات جانبی مثل تری هالومتان می‌گردد باعث ایجاد خورندگی در شبکه آبرسانی می شود، که این امر به کلونیزاسیون لژیونلا کمک می‌کند.

مطلب مرتبط : کلر زنی آب استخر 

تاریخچه مطالعاتی لژیونلا در ایران :

در مطالعاتی که توسط گودرزی و همکاران صورت گرفت از 210 کودک مبتلا به عفونت های حاد تنفسی، 12 نمونه از نظر ابتلا مثبت بودند. در مطالعه دیگری که توسط مرادزاده بر روی منابع آب محیطی و بیمارستان شهر اهواز انجام شد، نشان داده شد 15% از مجموع 100 نمونه از نظر حضور لژیونلا مثبت می‌باشد که فراوانی آنها در نمونه‌های بیمارستانی 8% و در نمونه‌های محیطی 7% بوده است. هم چنین احمدی جلالی مقدم و همکاران در مطالعاتی بر روی فراوانی لژیونلا در شیر آب سرد و گرم آب انکوباتورهای بخش نوزادان بیمارستان‌های گیلان نشان دادند حدود 8.5 درصد نمونه‌ها از نظر حضور لژیونلا مثبت بودند که 1/11 درصد از آب انکوباتور ها و 5.8 درصد از آب‌های شیر سرد و گرم جداسازی شدند. طی مطالعات دیگری که اسماعیلی و همکاران بر روی آب مصرفی بیمارستان‌های تهران انجام دادند، نشان داده شد از 32 بیمارستان 22 بیمارستان (% 7/68) به لژیونلا آلوده بودند.

برای مطالعه مقاله مزوزوم چیست در آسالب کلیک کنید.

روش های تشخیصی:

کشت متداول‌ترین روش آزمایشگاهی نظارت بر آب‌های محیطی است و برای جداسازی و شمارش میکروبی مناسب است. کشت باکتری لژیونلا هنوز روشی روتین در شناسایی باکتری به شمار می‌رود ولی با توجه به مشکلات روش کشت از جمله حساسیت کمتر آن و با توجه به اینکه جهت جداسازی لژیونلا از نمونه ها مدت زمان طولانی (حداقل 7 روز) نیاز می باشد، هم چنین زمان تشخیص طولانی درمان را در بیماران مبتلا با تاخیر روبه رومیکند.

به طور معمول وجود تعدادcfu/ml 10⁴-10⁵ لژیونلا پنوموفیلا برای انسان خطرناک است اطلاعات اپیدمیولوژیکی نشان می دهد که بیش ترین موارد اپیدمی با این تعداد لژیونلا در آب اتفاق می افتد نکته مهم این است که لژیونلا‌ها در شرایط خاصی از جمله مواجهه با فقر غذایی، استرس، فشار اسمزی و استرس اکسیداتیو (کلرزنی آب) به حالتی در می‌آیند که هنوز زنده بوده اما غیر قابل کشت هستند که اصطلاحاً Viable But Non Culturable (VBNC) نامیده می‌شوند که از نظر بهداشتی بسیار خطرناک می‌باشند زیرا می‌توانند قابلیت رشد خود را در شرایط مناسب باز یابند. امروزه روش‌های پیشرفته‌تری از جمله PCR مورد استفاده قرار می‌گیرند که محدودیت‌های کشت را ندارد. آزمون PCR به لحاظ مدت زمان آزمایش، سادگی و قابلیت شناسایی باکتری مرده دارای مزیت است. در این روش بخشی از توالی اختصاصی یک ژن انتخاب شده و با تکثیر این توالی، لژیونلا ردیابی می‌شود. بنابراین مشکل مربوط به نتایج منفی کاذب که در روش کشت با آن رو به رو بوده‌ایم (50-60%)  را نخواهیم داشت. مطالعاتی که در ایران بر روی لژیونلا انجام گردید نشان داده است که در تشخیص لژیونلا به روش کشت و روش PCR,  اختلاف معنا داری وجود دارد و نتایج منفی کاذب، حاصل از کشت غیر قابل چشم پوشی می‌باشد.

 ما در آزمایشگاه آزمون سلامت آسا با بکارگیری جدیدترین کیت‌ها و تجهیزات به روز دنیا با انتخاب توالی اختصاصی ژن هدف، قادر به ردیابی نمونه لژیونلا هستیم.

منابع وماخذ :

1- احمدی جلالی مقدم م، هنرمند ح، سلطانی تهرانی ب ، نوجوان م، اسفرم مشگین شهر. »فراوانی لژیونلا پنوموفیلا در شیر آب سرد و گرم ومخزن آب انکوباتورهای بخش نوزادان بیمارستان های گیلان«. مجله دانشگاه علوم پزشکی مازندران ، دوره بیست و دوم، اسفند 1393 : 321-312.

2-صفایی م،غنی زاده ق، اسماعیلی د. »کاربرد فرایند ازون زنی در حذف لژیونلا پنوموفیلا در آب «دو ماهنامه علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه، سال نوزدهم، شماره چهارم، مرداد و شهریور 94 : 197-206.

3-گودرزی ح، سید جوادی س، گودرزی م. »شناسایی لژیونلا پنوموفیلا از نمونه های خلط بیماران مبتلا به پنومونی با روش کشت ، ایمونوفلورسانس مستقیم وPCR « مجله پژوهشی دانشکده پزشکی شهید بهشتی . دوره 35، شماره 2، تابستان1390: 119-124.

4-مراد زاده م، موسویان م. »بررسی میزان آلودگی منابع آب محیطی و بیمارستان های شهر اهواز به باگتری لژیونلا، با استفاده از کشت وتکثیر ژن 16S rRNA « مجله تازه های بیوتکنولوژی سلولی- مولکولی ، دوره ششم، شماره بیست و سوم ، تابستان 1395: 47-52.

Refrence:

1. Allen JG, Myatt TA, MacIntosh DL, Ludwig JF, Minegishi T, Stewart JH, et al. Assessing risk of health care–

2. Borella P, Montagna MT, Stampi S,Stancanelli G, Romano-Spica V, Triassi M,et al. Legionella contamination in hot water of Italian hotels. Appl Environ Microbiol 2005; 71(10): 5805-5813. PMID: 16204491

3. Carratala J, Garcia-Vidal C. An update on Legionella. Curr Opin Infect Dis. 2010;23(2):152-7.

4. Declerck P, Behets J, van Hoef V, Ollevier F. Replication of Legionella pneumophila in floating biofilms. Curr

Microbiol. 2007;55(5):435-40.

5. Gruas C, Llambi S, Arruga MV. Detection of Legionella spp. and Legionella pneumophila in water samples of

Spain by specific real-time PCR. J Arch Microbiol. 2014;196(1):63-71.

6. Helbig JH, Bernander M, Castellani-Pastoris M, Etienne K, Gaia V, Lauwers S, et al. PanEuropcan study

On culture-proven Legionnaire’s disease: distribution of Legionella Pneumophila serogroups and monoclonal subgroups.m Eur J Clin MicrobInfectDis 2002; 21:710-716.PMID:12415469

7. Jalila T, Benchekroun MN, Ennaji MM, Mekkour M, Cohen N. Nosocomial Legionnaires’ disease: Risque and

prevention. Int J Environ Sci Res. 2012; 1(3):72-85.

8. Kim B, Anderson J, Mueller S, Gaines W, Kendall A. Literature reviewe-efficacy of various disinfectants

against Legionella in water systems. J Water Res. 2002;36(18):4433-44.

9 Lau H, Ashbolt N. The role of biofilms and protozoa in Legionella pathogenesis: implications for drinking

water. J Appl Microbiol. 2009;107(2):368-78.

1. 1. Motaharinia Y, Shapuri R,Rahnama M, Aliramaie MR, Rahmani MR, Rezaie MA. [Isolation of legionella

pneumophila from environment and water system samples and evaluation of immuno-protective efficiency of

its whole killed cell in mice model (Persian)]. Sci J Kurdistan Uni Med Sci. 2010;15(2):70-8.

11. Westerlaken M. Biological mechanisms behind Legionella control. 1 St ed. Science Shop for Biology. Utrecht University. 2006;1-29

12. Zhang Z, McCann C, Hanrahan J, Jencson A, Joyce D, Fyffe S, et al. Legionella control by chlorine dioxide in

hospital water systems. J AWWA. 2009;101(5).117-127.‌